RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鍊RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達,且具有特異、高效等優點,RNAi已被廣泛用于敲減各種基因的表達,具有廣闊的應用前景。
2006年,斯坦福大學的安德魯·法厄(Andrew Z. Fire)與馬薩諸塞大學的克雷格·梅洛(Craig C. Mello)由于在RNAi機制研究中的貢獻而共同獲得諾貝爾生理醫學獎。
安德魯·法厄 克雷格·梅洛
RNA幹擾的作用機制
化學和遺傳學研究表明,RNA幹擾包括起始階段(initiation steps)和效應階段(effector steps)兩個部分。
起始階段:外源或内源的雙鍊RNA(dsRNA)進入細胞後,被RNase III家族核酸酶(Dicer,DCR)以ATP依賴的方式切割為長約21~24個核苷酸(Nucleotide,nt)的片段,即小片段幹擾RNA分子(siRNA)。Dicer酶屬于RNase III家族中不常見的成員,具有高度的保守性,在包括線蟲、果蠅、拟南芥和哺乳動物等大多數的生物體内都能找到它的同源物。但是在不同生物體内,Dicer的結構域有細微的區别。dsRNA被Dicer酶切割成長為21~25nt的siRNA後,這些siRNA帶有5’單磷酸和3’羟基末端,互補雙鍊的3’端有2~3nt垂懸,這些siRNA分子則引導同源單鍊RNA(ssRNA)即目标mRNA的降解 。
效應階段:siRNA與某些作用因子結合形成無活性的RNA誘導的沉默複合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。在ATP依賴的RNA解旋酶的作用下,RISC中雙螺旋的siRNA解鍊,随後siRNA的同義鍊被消除,反義鍊與RISC中的核酸内切酶Ago-2結合,RISC重新折疊成有活性的RISC。在靶mRNA的降解過程中,首先是通過結合在RISC上的siRNA反義鍊指導RISC識别靶mRNA。RISC與靶mRNA結合并在核酸内切酶Ago-2的作用下在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA,将其降解,完成siRNA介導的RNAi過程。
圖1. RNA幹擾作用機制的模式圖
siRNA不僅能引導RISC切割同源單鍊mRNA,而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割産生大量的次級siRNA,從而使RNAi的作用進一步放大,最終将靶mRNA完全降解。
RNAi技術應用的關鍵點
為了将RNAi的原理應用于生物技術層面上,必須有适當的方式将外源性的siRNA(small interference RNA)導入到目标生物體内,siRNA一般為19~21個核苷酸大小,在生物體内經過一系列生化路徑,引發RNA幹擾效果。
siRNA的來源
1. 試管内合成:以人工方式合成所需的siRNA片段,再用PCR的方式放大産量,最後導入目标細胞當中,此方法取決于細胞的轉染效率,并且由于siRNA的數量無法穩定地持續存在,無法實現長期的 RNA幹擾效果;
2. 生物體内合成:将所需要的siRNA片段用載體導入目标細胞中,此方法避免了單純以人工方式在試管中合成siRNA的局限性。
設計siRNA載體
通常選擇用質粒作為将siRNA導入細胞的載體,被導入的載體能在生物體内産生類似于miRNA的發夾型siRNA,為了在生物體内合成siRNA,所設計的載體DNA應該包含以下幾部分:
1. 同義鍊(sense strand):與生物體内轉錄出目标mRNA時所需的基因序列相同;
2. 反義鍊(antisense strand):與同義鍊互補配對,轉錄此序列則可得到與目标mRNA互補的siRNA;
3. 非互補的序列:使得載體經轉錄後,能形成發夾結構;
4. 其他基因經限制性酶切割的限制部位(如:BamH I &Hind III)。
設計siRNA序列
除了選擇恰當的siRNA載體外,所需要的siRNA序列需要注意以下幾點:
1. 設計使得末端含有5-6個A(T):siRNA載體是由RNA聚合酶III轉錄而表達,RNA聚合酶III可轉錄哺乳動物體内大部分的小片段RNA,其特點是:當轉錄到5-6個腺嘌呤核苷酸A時會停止轉錄,故導入的siRNA載體經轉錄後,可得到末端具有5-6個尿嘧啶的siRNA;
2. 選擇2-5個目标基因的不同部分序列:生物體内的目标mRNA,可能部分區域被調節蛋白附着,造成RNAi不易進行,故要選擇轉錄出目标mRNA的不同基因片段,才能使得抑制基因表達的效率提升。
RNAi作用的特征
RNAi是由雙鍊RNA引起的序列特異的轉錄後基因沉默,即外源基因的轉入隻對成熟 RNA的産生作用,對RNA前體沒有或很少具有影響,所以含有内含子或啟動子序列的外源dsRNA是無法引起RNAi效應的。将外源 dsRNA引入生物體内能特異地抑制有同源序列基因的表達,産生類似于目的位點的無義突變表型。RNAi的效應有以下幾個明顯特征:
1. RNAi是轉錄後水平的基因沉默機制;
2. RNAi具有很高的特異性,隻降解與之序列相應的單個内源基因的mRNA;
3. RNAi抑制基因表達具有很高的效率,表型可以達到缺失突變體表型的程度,而且很少量的dsRNA分子(數量遠遠少于内源mRNA的數量)就能完全抑制相應基因的表達,是以催化放大的方式進行的;
4. RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限,在不同細胞間長距離傳遞和維持信号甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點;
5. dsRNA不得短于21個堿基,并且長鍊dsRNA也在細胞内被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA,并由siRNA來介導mRNA切割,而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA幹擾,而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡;
6. ATP依賴性:在去除ATP的樣品中RNA幹擾現象降低或消失,這顯示RNA幹擾是一個ATP依賴的過程,可能是Dicer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。
RNAi應用方向
RNAi可運用于許多方面,其原理都是用基因沉默的方式抑制基因表達,達到所需的目的。例如:
1. 生物體的研究:運用RNAi的方式,研究某個基因在生物體内的功能,比如說在信号通路、胚胎發育等等方面的功能;
2. 作物改良:減少作物中會引起過敏的蛋白質成分;
3. 基因治療:在疾病治療方面,雙鍊小分子RNA或siRNA已被用于臨床測試用于幾種疾病治療,如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側索硬化症、類風濕性關節炎、肥胖症等;在抗病毒治療方面,帕金森病等神經系統疾病已經開始初步采用RNA幹擾療法;腫瘤治療方面也已經取得了一些成果。
RNA幹擾回複實驗
RNA幹擾回複實驗,主要是為了說明脫靶效應,即off-target效應。簡單來說,脫靶效應是指幹擾RNA序列進入了microRNA途徑,通過microRNA途徑,其可以不受完全互補的限制而調控大量靶基因的表達。原本需要19~23nt的RNA序列完全互補才能發生幹擾作用,而如果進入microRNA途徑,隻需要11~15nt互補就可以産生幹擾效果,這使得siRNA可能與非靶基因結合而導緻非靶基因沉默,造成脫靶。如果脫靶幹擾的部分基因,正好與目的基因位于同一信号通路中,或者與目的基因的生物學功能相似,那麼,如果因脫靶而幹擾了其他基因,也會造成和目的基因被幹擾後相類似的表型,而實際上,可能選擇的這條siRNA序列并沒有對目的基因造成有效幹擾,或者雖然幹擾了目的基因,但是并不會引起預期的表型。
基于以上原因,越來越多的雜志要求研究者們在投稿時需要有相應的對照來說明脫靶效應,即需要有相關對照或者實驗來說明,研究者們所獲得的實驗結果,不是由于脫靶效應産生的,脫靶效應極大地限制了RNA幹擾技術的發展和使用。