光遺傳學（optogenetics）是結合了光學（optics）及遺傳學（genetics）的技術，能在活體動物甚至是自由運動的動物腦内，精準地控制特定種類神經元的活動。光遺傳學在時間上的精确度可達到毫秒級别，在空間上的精确度則能達到單個細胞級别。2010年，光遺傳學被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認為是近十年來的突破之一。這項技術目前在神經科學領域應用非常廣泛，未來可能會應用于多種神經和精神疾病的治療，如帕金森氏病、阿爾茨海默病、脊髓損傷、精神分裂症等。

圖1.光遺傳學技術

光遺傳學之前

1979年諾貝爾獎得主弗朗西斯·克裡克首次提出，為了了解大腦如何運作，我們需要一種方法，可以每次隻讓某一特定型态神經元活動被抑制，而不影響其他神經元的活動。在光遺傳學技術之前，人們通常采用電刺激來進行神經科學的相關研究，即将電極埋入動物腦内，然後用電刺激激活神經元，但是其最大的缺點是對于神經元的操作沒有特異性，而且無法進行精确定位，因此所得出的研究結果往往缺乏特異性，另外，用電刺激隻能激活神經元，而無法抑制神經元的活動。

随着基因工程技術的發展，科學家開始利用化學藥物聯合轉基因技術來精确定位特定的神經元并進行相關研究，盡管解決了特異性問題，但是化學刺激的方法在時間上的精确度缺乏保證。

因此神經科學家們急切需要一種能以非常高的時間精确度、特異性地激活或者抑制特定種類神經元活動的方法。

光遺傳學的發展曆程

早在1973年，微生物學家便發現細菌視紫質（Bacteriorhodosin）光照之後會成為離子轉運蛋白，1977年發現鹽細菌視紫紅質（Halorhodopsin，NpHR）也是離子轉運蛋白，照黃綠光後會将氯離子打出細胞，2002年發現光敏感通道（Channelrhodopsins），藍光照射之後會将陽離子打進細胞。

2005年9月份，斯坦福大學的Karl Deisseroth實驗室在nature neuroscience上發表了一篇Technical Report，第一次将Channelrhodopsin-2（ChR2）表達在神經元裡，發現可以用藍光精确地控制神經元的活動（圖2），而光遺傳學（optogenetics）一詞也随之出現。随後發現Bacteriorhodosin與Halorhodopsin也都能在神經元表達，準确調控神經元的活動，并不會對神經元産生毒害作用。此後，光遺傳學迅速改變神經科學界，成為研究特定神經元在大腦中扮演何種角色不可或缺的工具。

圖2.将ChR2表達在神經元膜上，然後用470nm藍色激光進行照射

光遺傳學的基本原理

當神經元處于靜息狀态時，細胞膜兩邊存在着電位差，這就是靜息電位。靜息電位的産生是由于膜内外各種離子的分布不均衡，以及細胞膜在不同情況下，對各種離子的通透性不同造成的。在靜息狀态下，細胞膜對K+有較高的通透性，且膜内K+又高于膜外，K+順着濃度差向膜外擴散；細胞膜對陰離子（A-）無通透性，膜内大分子A-被阻止在膜的内側，從而形成膜内為負、膜外為正的電位差，這種電位差産生後，可阻止K+進一步向外擴散，使膜内外電位差達到一個穩定的數值，即靜息膜電位（resting membrane potential）。當神經元受到刺激而興奮時，在靜息電位的基礎上，發生一次擴布性的電位變化，稱為動作電位（action potential）。動作電位是一個連續的膜電位變化過程，細胞膜受刺激而興奮時，膜上Na+通道迅速開放，由于膜外Na+濃度高于膜内，電位比膜内正，所以，Na+順濃度差和電位差内流，使膜内的負電位迅速消失，并進而轉為正電位。這種膜内為正、膜外為負的電位梯度，阻止Na+繼續内流。當促使Na+内流的濃度梯度與阻止Na+内流的電位梯度相等時，Na+内流停止，即達到了動作電位的峰值。因此，動作電位的産生和Na+内流息息相關。

光遺傳技術的基本原理如圖所示（圖3）。首先，給神經元轉入膜通道蛋白，如ChR2或NpHR。對于ChR2來說，當有473nm的藍色激光照射時，這些通道蛋白的通道打開，允許陽離子（如Na+）大量内流，産生動作電位，即讓神經元處于興奮狀态。對于NpHR來說，當有580nm的黃色激光照射時，這些通道蛋白的通道打開，允許Cl-通過，使神經元一直處于靜息電位，即讓神經元保持靜息狀态。

圖3.光遺傳學的基本原理（以ChR2和NpHR為例）

光遺傳學技術的研究步驟

光遺傳學技術的應用主要包括以下幾個關鍵步驟（圖4）：

1.  需要尋找合适的光敏蛋白：例如起興奮神經元作用的Channelrhodopsin-2（ChR2），起抑制神經元作用的Halorhodopsin（NpHR）和Archaerhodopsin（Arch）等，這類蛋白質具有天然的光敏性，或經過修飾後具有光敏性；

2.  将遺傳信息傳遞給靶細胞：一般通過病毒轉導、轉染、轉基因動物等方式将光敏蛋白的遺傳信息傳遞給靶細胞；

3.  可控性演示：即通過導入光纖、控制激光來實現對神經元活動的精确控制；

4.  實驗方法的有效性驗證：一般采用電極記錄神經元細胞膜内外電壓變化，以此來驗證光遺傳的有效性；

5.  表型檢測：通過行為學測試來評估神經元活動對動物行為的影響。

圖4.光遺傳學實驗基本步驟（以ChR2為例）

幾種激活神經元的通道蛋白

1.  ChR2(H134R)：ChR2的突變體，将第134個氨基酸由組胺酸突變為精胺酸，該蛋白質可以産生兩倍的光電流，但通道開關速度也比野生的ChR2慢了一倍；

2.  ChR2(C128S/D156A): ChR2的突變體，超靈敏光敏感通道，用藍色激光打開通道，然後用綠色或黃色激光關閉通道，可以打開其離子通道長達30分鐘；

3.  ChR2(E123T/T159C): ChR2的突變體，更大的光電流和更快的動力學變化；

4.  ChETA：ChR2的突變體，使得神經元在激光刺激下可以發放200Hz的spike，而其他的ChR2 通道蛋白隻能達到40Hz；

5.  C1V1：由ChR1及由團藻發現的VChR1組合在一起的通道蛋白，在紅色激光刺激下打開通道。

幾種抑制神經元活動的通道蛋白

1.  NpHR：即為Halorhodopsin，第一個有效抑制神經元活動的光遺傳學工具，在黃綠激光照射下會将氯離子打進神經元内，而抑制神經元活動。當把NpHR表達在哺乳動物腦内時，會聚集在内質網上，而如果将内質網輸出元件加在NpHR基因序列後面，這樣可以使得NpHR在胞内高量表達，而且不會聚集在内質網上，這樣修改過的NpHR被稱為eNpHR2.0。但是eNpHR2.0在細胞膜的聚集仍然不夠，而将一個高爾基體輸出元件和來自于鉀離子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列後面，這樣就能實現在神經元細胞膜上的高量聚集，這樣修改過的NpHR被稱為eNpHR3.0；

2.  Arch：即為archaerhodopsin，是一種黃色激光激活的外向整流質子泵，能夠将帶正電的質子從神經元内移動到細胞外環境中，使神經元處于超極化狀态，從而保證神經元處于靜息狀态。在特定條件下，可用于增加細胞内pH或減少細胞外基質pH。和NpHR相比，當激光關閉的時候，Arch立即從通道打開狀态恢複到關閉狀态。

3.  Mac:即為 Leptosphaeria maculans fungal opsins，藍色激光激活的質子泵，能夠将帶正電的質子從神經元内移動到細胞外環境中，使神經元保持超極化狀态，從而保證神經元處于靜息狀态。

結語

光遺傳技術具有獨特的高時空分辨率和細胞類型特異性兩大特點，克服了傳統手段控制細胞或有機體活動的許多缺點，能對神經元進行非侵入式的精準定位刺激操作而徹底改變了神經科學領域的研究狀況，為神經科學提供了革命性的研究手段。光遺傳技術在将來還有可能發展出一系列針對中樞神經系統疾病的新療法。