化學遺傳學是指:對一些生物大分子實行改造,使其能和先前無法識别的小分子進行相互作用的過程。化學遺傳學和分子遺傳學一樣,均是遺傳學的一個分支,由于其可控的、可逆的(可以随時加入或除去化合物,從而啟動或中斷特定的反應)特性,已經在信号轉導、藥物開發、功能基因組學等方面的研究中得到了廣泛的應用。
目前已改造的生物大分子包括核酸雜交、蛋白質激酶、各種代謝酶和G蛋白耦聯受體(G protein–coupled receptors,GPCRs)。現在有很多基于GPCRs改造的化學遺傳學平台,例如基因編碼受體的等位基因特異激活(allele-specific activation of genetically encoded receptors)、隻能被合成配體激活的受體(receptors activated solely by synthetic ligands, RASSLs)、基因工程改造的受體(engineered receptors)和隻由特定藥物激活的受體(designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs)。其中,DREADDs已成為應用最廣泛的化學遺傳學技術,本文也将主要讨論DREADDs技術。
DREADDS技術
現在有很多由疊氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)激活的DREADDs,他們會選擇性地作用于不同的GPCR級聯反應,包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin,其中應用最廣泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。
1. Gq-DREADD和hM3Dq
最初的Gq-DREADD即hM3Dq改造自人毒蕈堿型乙酰膽堿受體(the human muscarinic acetylcholine receptor,mAchRs)亞型M3(也稱為hM3)。在正常生理狀況下,hM3和乙酰膽堿結合,然後和Gq類G蛋白耦合受體耦合,作用于磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞内鈣離子這一信号通路(如圖1)。令人吃驚地是,隻要将Y3.33C和A5.46這兩個位點突變,就能使hM3受體不能和乙酰膽堿耦合,但是會和納摩爾濃度級别的CNO結合,這種突變後的hM3受體被命名為hM3Dq (human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)。由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型中是保守的,M1和M5也已經被成功改造為Gq-DREADD(hM1Dq和hM5Dq)。但是到目前為止,hM3Dq仍然是應用最多的Gq-DREADD。在不同的細胞類型中,CNO誘導hM3Dq的結果是不一樣的,比如:
1) 在成熟神經元中,CNO誘導hM3Dq的結果是将神經元去極化(depolarization),加強神經元的興奮性,這也是hM3Dq最常用的功能,即促使神經元的放電活動;
2) 在星形膠質細胞中,有人報道CNO誘導hM3Dq的結果是增加星形膠質細胞Ca+的釋放,從而改變自主神經系統的生理條件;
3) 在神經系統以外,也有一些研究,例如在胰腺Β細胞表達hM3Dq,急性CNO處理會促進胰島素的釋放,而慢性CNO處理導緻Β細胞數目增加;在肝細胞中,激活hM3Dq會增加血糖水平,也許是因為糖原分解和糖異生作用增加。
圖1. hM3和乙酰膽堿結合,作為信号分子激活Gq耦聯的GPCRs信号通路
2. Gi-DREADD和hM4Di
Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型中是保守的,因此科學家同樣可以突變M2和M4 mAchRs上的Y3.33、A5.46位點,産生Gi- DREADDs,命名為hM2Di和hM4Di,他們可以激活Gi調節的信号通路(如圖2)。因為Gi耦合的GPCRs可以激活G蛋白内向整流鉀通道(内向整流鉀離子通道,GIRK),所以hM2Di和hM4Di可以抑制神經元的放電活動,其中使用最多的Gi-DREADD是hM4Di。也有研究表明,hM4Di可以抑制神經遞質的釋放,從而達到抑制神經元活動的效果。
圖2. hM4和乙酰膽堿結合,作為信号分子激活Gi耦聯的GPCRs信号通路
DREADDs技術的研究步驟
DREADDs技術的應用主要包括以下幾個關鍵步驟(如圖3):
1. 根據實驗目的,确定合适的DREADDs受體:一般來說,如果是想激活神經元,則選擇hM3Dq,如果是想抑制神經元的活性,則選擇hM4Di;
2. 将遺傳信息導入到動物體内:一般通過病毒注射或者轉基因動物的方式将遺傳信息傳遞給靶細胞;
圖3. DREADDs實驗基本步驟
3. 可控性演示:即通過控制CNO的給藥時間,實現對細胞神經元活動的控制;
4. 實驗方法的有效性驗證:一般采用電極記錄神經元細胞膜内外電壓變化,以此來驗證DREADDs受體的有效性;
5. 表型檢測:通過實驗确認激活或者抑制神經元活動給實驗動物帶來的影響。
DREADDs技術的優缺點
作為兩種最常見的控制神經元活動的技術,optogenetics(光遺傳學)和DREADDs技術之間各有優缺點,下面我們就以光遺傳學為參照對象,談談DREADDs技術的優缺點。
1. DREADDs技術的優點主要有:
1) 實驗要求較低:如果要使用光遺傳技術,需要準備很多配件,例如光纖、激光控制器和導管等等,而DREADDs隻需用注射或者喂食CNO即可;
2) 操作較簡單:也正是因為光遺傳需要很多配件,而DREADDs不需要,所以在實驗操作的過程中,DREADDs相對來說比較簡單;
3) 較長時間的處理:對于光遺傳來說,由于激光産熱等機械限制,長時間處理幾乎不可能實現,而持續CNO給藥已經證明是可行的。
2. DREADDs技術的缺點主要有以下兩點:
1) 操作神經元活動的時間精确度不高:由于optogenetics可以通過控制激光使時間精準度到毫秒級别,而DREADDs通過CNO連分鐘級别的精度程度都很難達到,而且CNO作用在神經元上之後一般需要2小時才能從膜上清除,所以說DREADD操作神經元活動的時間精确度不高;
2) 刺激的強度無法掌控:雖然研究人員可以增加或者減少CNO的給藥量,但是用DREADDs還是不可能控制給神經元刺激的量,而且也不能随時增強或者減弱刺激,但是光遺傳通過控制激光,可以精準地、随時地調節給神經元刺激的強度,這對于某些刺激強度依賴的神經環路研究有不可替代的優勢;
結語
至少到目前為止,DREADDs最主要的應用還是在神經科學研究方面,他們被廣泛用于以細胞特異性、無創地增強或抑制神經元的活動。雖然DREADD缺乏像光遺傳學那樣精準的時間控制能力,但是由于在進行疾病治療時,最有可能需要的是長期神經元環路調節,而DREADDs會非常适合這類應用。此外,許多FDA批準藥物的目标作用目标是GPCRs,而DREADDs是改造過的GPCRs,因此DREADDs可能會在藥物開發方面提供豐富的可能性。