鈣成像技術（calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監測組織内鈣離子濃度的方法。在神經系統研究方面，在活體（in vivo）或者離體（in vitro）研究中，鈣成像技術被廣泛應用于同時監測成百上千個神經元内鈣離子的變化，從而檢測神經元的活動情況（如圖1）。有了鈣成像技術，原本悄無聲息的神經活動就變成了一幅斑斓閃爍的壯觀影像，科學家終于可以親眼看着神經信号在神經網絡之中往來穿梭。因此，這種技術一出現，就受到了全世界神經科學家們的追捧，至今依然是人們觀測神經活動最為直接的手段。

鈣成像技術的基本原理

在生物有機體内，鈣離子産生各種各樣的胞内信号，這些胞内信号幾乎在每種類型的細胞中都存在，在很多功能方面有重要作用，例如心髒肌細胞收縮的控制和從細胞增殖到細胞死亡整個細胞周期的調節等。在哺乳動物的神經系統中，鈣離子是一類重要的神經元胞内信号分子。在靜息狀态下，大部分神經元的胞内鈣離子濃度為50-100nM，而當神經元活動的時候，胞内鈣離子濃度能上升10-100倍，增加的鈣離子對于含有神經遞質的突觸囊泡的胞吐釋放過程必不可少。也就是說神經元的活動與其内部的鈣離子濃度密切相關，神經元在放電的時候會爆發出一個短暫的鈣離子濃度高峰。神經元鈣成像技術的原理就是借助鈣離子濃度與神經元活動之間的嚴格對應關系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質熒光探針（鈣離子指示劑，calcium indicator），将神經元中的鈣離子濃度通過熒光強度表現出來，從而達到監測神經元活動的目的。

鈣離子指示劑

現在廣泛使用的鈣離子指示劑有化學性鈣離子指示劑（chemical indicators）和基因編碼鈣離子指示劑（genetically-encoded indicators）兩類：

1.  化學性鈣離子指示劑：指的是可以螯合鈣離子的小分子，所有這些小分子都基于EGTA（乙二醇雙四乙酸）的同系物BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA能夠特意地和鈣離子螯合，而不會和鎂離子螯合，所以被廣泛地用作鈣離子螯合劑。現在使用較廣泛的化學性鈣離子指示劑有：Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。

2.  基因編碼鈣離子指示劑：這些指示劑是來自于綠色熒光蛋白（GFP）及其變異體（例如循環排列GFP，YFP，CFP）的熒光蛋白質，與鈣調蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鍊激酶M13域融合。現在使用較廣泛的基因編碼鈣離子指示劑有：GCaMP、Pericams、 Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由于它有着超強的敏感度，現在被廣泛應用于活體鈣成像研究。

鈣成像技術在神經科學研究中的應用舉例

總體上，不論采用哪一類鈣離子指示劑，成像記錄過程都是非常類似的。包含鈣離子指示劑的細胞可以通過熒光顯微鏡（fluorescence microscope）觀測，然後通過CCD攝像機捕捉、記錄。現在鈣成像技術主要在以下幾類神經科學研究方面有廣泛應用：

1.  記錄培養的神經元的活動，如 ；

2.  記錄腦片上神經元的活動，如 ；

3.  活體記錄神經元的活動。由于離體實驗本身的限制，現在越來越多的神經科學家傾向于做活體鈣成像實驗，希望能得到更準确且更能反應生理狀況的數據。得益于雙光子熒光顯微鏡的發展，現在，在實驗動物處于活體狀态下進行鈣成像記錄的技術取得了飛速進展，如 ，即為小鼠在跑步機上處于休息或者跑步狀态下記錄的神經元反應；

4.  活體記錄神經元樹突和樹突棘（spine）的活動。由于對實驗精度的要求，有些科學家不僅僅想記錄單個神經元的反應，他們還想更精确地知道神經元上哪些樹突和樹突棘參與了某個行為，也就是說他們需要在活體條件下，對單根樹突以及樹突上spine進行鈣成像記錄實驗。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發展，現在，對樹突和樹突棘用鈣成像實驗進行記錄也成為了可能。如視頻4，在給小鼠不同方向視覺刺激的情況下，在初級視覺皮層（V1）進行單根樹突以及樹突上spine的鈣成像記錄。

CaMPARI:瞬間即永恒

傳統的鈣成像技術受限于顯微鏡的視野，隻能對很小的一片區域進行記錄。随着神經科學的進步，人們認識到大腦運作需要借助許多不同腦區的相互協作，要對這些過程進行研究，需要對整個大腦的神經活動進行細緻的觀測，而傳統的鈣成像技術在這一方面毫無辦法。另外，由于傳統鈣成像實驗要求成像的光路極為穩定，因此科學家需要把實驗動物的腦袋固定起來以方便成像實驗。腦袋被固定的實驗動物，大腦活動與自由狀态下勢必存在差别，對科研家而言，這樣獲得的數據可能還是不夠準确。正因如此，神經科學迫切需要一種能夠兼顧全局和微觀的新型鈣成像技術，這就是2015年2月份科學家在著名雜志Science上發表的文章所要解決的問題，他們介紹了一種全新的蛋白CaMPARI（calcium-modulated photoactivatable ratiometric integrator）。

CaMPARI蛋白在正常狀态下會發出綠色熒光（green），而如果對這種蛋白同時使用高濃度鈣離子與紫外光處理，它就會不可逆、永久地轉變成另一種能發出紅色熒光（red）的構象，即實現将瞬間的神經元活動變成永久的紅色熒光蛋白表達（如圖2）。研究人員通過轉基因技術将這種新型蛋白導入到實驗動物的神經系統中，然後用高強度的紫外光照射動物的大腦，通過檢查熒光，找到發紅色熒光的神經元，這些神經元即是在紫外光照射期間活躍的神經元。由于紫外光可以對着整個大腦進行照射，所以理論上，人們可以對全腦進行檢查。

圖2.在紫外照射期間，一個活躍的神經元（紫紅色）和一個不活躍的神經元（綠色）

為了驗證CaMPARI的效果，science文章研究團隊分别在斑馬魚、果蠅和小鼠這三類主要的模式動物身上進行了測試。例如，由于斑馬魚的頭部完全透明，所以斑馬魚經常被用作為鈣成像的模式生物。研究團隊通過簡單的方法改變斑馬魚的狀态，然後通過CaMPARI檢測不同狀态下斑馬魚腦部的神經活動。結果顯示CaMPARI可以良好地反應斑馬魚腦部的神經活動，比如在麻醉狀态下，斑馬魚神經元的活動因為受到抑制而表現出一片綠色，而當有藥物誘導癫痫的狀态下，神經元的廣泛異常放電導緻紅色熒光蛋白的表達異常豐富（如圖3）。

圖3.在斑馬魚身上驗證CaMPARI蛋白的效果，結果顯示CaMPARI可以很好地反應斑馬魚的神經活動。

Science文章第一作者孫一指出：作為一種快速靈敏的神經活性标記技術，CaMPARI可能在腦功能圖譜和連接組學的研究方面有着重要且廣泛的應用價值。